1  適用范圍

酶底物法適用于生活飲用水及其水源水、地表水、污水、廢水等水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）的定性檢測、定量檢測

2  方法原理

固定底物酶底物法（DST）采用大腸菌群細菌能產生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培養液呈黃色的原理，來判斷水樣中是否含糞大腸菌群（耐熱大腸菌群），糞大腸的培養溫度是44.5℃。

3  儀器設備

3.1 程控定量封(feng)口機（酶底物法程控定量封(feng)口機）

智能程控定量封口機是由智能電路電驅動，內部專用加熱輥，專門用于51孔定量盤和 97 孔定量盤封膜作用，配合微生物檢測試劑使用，提供簡單、快速、準確的定量檢測總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞（耐熱）大腸菌群、腸球菌和綠膿假單胞菌的實驗方案；51 孔定量盤和 97 孔定量盤是基于傳統方法ZUI大可能數 (MPN) 統計模型而設計的半自動定量方法，可定量檢測出水樣結果，這種方法可以替代并優于傳統（濾膜、及多管發酵）方法檢測水中微生物。

3.2電熱恒溫培養箱

3.3 冰箱

3.4 51孔定量盤、97孔定量盤

3.5 100ml無菌水樣瓶

3.6 高壓蒸汽滅菌鍋

3.7 干熱滅菌器

3.8 量筒

3.9 吸管

3.10 試管

4  培養基和試劑

4.1 科立得（固定底物技術酶底物法）檢測試劑：MMO-MUG培養基

4.2 無菌水

5  樣品的采集和保存

5.1采樣前準備：

5.1.1 采樣瓶：采用IDEXX公司科立得 系統配套的滅菌100毫升消毒帶刻度容器。

5.2 樣品采樣及注意事項

5.2.1將已滅菌和封包好的采樣瓶，無論在什么條件下采樣時，均要小心開啟包封紙和瓶蓋，避免瓶蓋及瓶子頸部受雜菌污染，并注意在使用船只或附帶的采樣繩等附加設備采樣時可能造成的污染。

5.2.2 在采集江、河、湖、庫、地表水樣時，可握住瓶子底部直接將采樣瓶插入水中，約距水面10~15厘米處，瓶口朝來水方向，使水樣灌入瓶內。如果沒有水流，可握住瓶子水平前推，直至充滿水樣為止。采好樣后，迅速蓋上瓶蓋和包裝紙。采樣后，采樣瓶內上部應留有一些空隙，以便檢驗前充分混勻水樣。

5.2.3 用采樣器采樣時，將無菌的水樣瓶放入架內。將采樣裝置放入水中。到達預定深度后，打開瓶塞，待水樣灌好后，松開瓶塞的軟繩，蓋上瓶蓋。再將整個裝置提出水面。

5.2.4 從自來水龍頭采集樣品時，不要選用漏水的龍頭，采水前可先將水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌或用70%的酒精溶液消毒水龍頭及采樣瓶口，然后將水龍頭完全打開，放水數分鐘后除去水管中的滯留雜質。采水時控制水流速度小心接入瓶內。

5.2.5在同一采樣點進行分層采樣時，應自上向下進行，以免不同層次的攪擾；同一采樣點與理化監測項目同時采樣時，應先采集細菌等檢驗樣品，否則樣品可能被污染，采樣前，不得用水樣刷洗采樣瓶。

5.2.6采樣完畢，應將采樣瓶編號、作好采樣記錄。將記錄下采樣條件，填入采樣表格內。

5.2.7 樣品的運輸和保存

采好的水樣，應迅速運往實驗室，進行細菌學檢驗，一般從取樣到檢驗不宜超過2小時，不然應使用10℃以下的冷藏設備保存樣品，但不得超過6小時，實驗室接到送檢樣后，應將樣品立即放入冰箱，并在2小時內著手檢驗。如果因路途遙遠，送檢時間超過6小時者，則應考慮現場檢驗。

5.3 樣品交接

樣品運回實驗室后，由采樣人員與質管科樣品管理人員進行交接。雙方需對樣品名稱、編號、樣品采集點名稱、采樣時間、數量、采樣人簽名等進行登記核實。如在驗收過程中，發現編號錯亂、字跡不清、規格不符、監測項目不明及采樣不合要求者，可拒收并建議補采。如無法補采，應經領導批準，方可收樣測定。樣品管理人員收樣后應盡快轉交檢測人員以便及時進行分析。

5.4干擾與消除：防止操作過程中的污染，嚴格無菌操作。

6  操作步驟

6.1 水樣稀釋

檢測所需水樣為100mL。若水樣污染嚴重，可對水樣進行稀釋。取10 mL水樣加入到90 mL無菌水中，必要時可加大稀釋度，水樣按照10倍逐級稀釋。

6.2 定性反應

用100 mL的無菌稀釋瓶量取100 mL水樣，加入科立得培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解后，放入44.5℃的培養箱內培養24h。

6.3 51孔定量盤法

6.3.1 用100 mL的無菌稀釋瓶量取100 mL水樣，加入科立得培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解。

6.3.2 將前述100mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內氣泡，然后用程控定量封口機封口。放入44.5℃的培養箱內培養24h。

6.3.3 無需稀釋檢測范圍：1-200MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

6.4 97孔定量盤法

6.4.1 將100mL水樣全部倒入97孔無菌定量盤內，其余步驟與6.3.1、6.3.2條款相同。

6.4.2 無需稀釋檢測范圍：1-2419MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

7  結果報告

7.1 結果觀察與報告

7.1.1 結果判讀

將水樣培養24h后進行結果判讀，如果結果為可疑陽性，可延長培養時間到28h進行結果判讀，超過28h之后出現的顏色反應不作為陽性結果。

7.1.2 定性反應

水樣經24h培養之后如果顏色變成黃色，判斷為陽性反應，表示水中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。水樣顏色未發生變化，判斷為陰性反應。定性反應結果以糞大腸菌群檢出或未檢出報告。

7.1.3   51孔定量盤法、97孔定量盤法

7.1.3.1 將培養24h的水樣的定量盤取出觀察，如果顏色變成黃色則表示定量盤孔中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。若無法明顯辨別黃色孔格，則可借助97孔陽性比色盤比色判讀。檢測結果說明如下：

7.1.3.2 計算有陽性反應的孔穴數，對照附表1：51孔定量盤MPN表或者附表2：97孔定量盤MPN表查出代表的糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）最可能數。結果以MPN/100mL表示。如所有孔未產生黃色，則可報告為糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）未檢出。

7.1.3.3 在無需稀釋檢測范圍內直接可讀出結果。若水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）污染嚴重，超出定量范圍（全部孔格顯黃色）則需要稀釋，讀取結果后再乘以稀釋倍數。

8  質控

每批科立得試劑需做驗證檢驗：向一份100mL無菌水樣中接種含有糞大腸菌的質控樣標準菌株，按照上述定量檢測步驟操作觀察結果，看結果是否在其范圍內。

9  注意事項

9.1 如果水樣品有背景顏色，需做一個空白試驗，與科立得標準檢測結果相比較。

9.2 只可使用滅菌水，不含緩沖液的水，不含氧化劑的水進行樣品稀釋。

9.3 此法所用試劑只用于常規水樣，不可用于濃縮水樣。

9.4 如水樣中含有過多的氯，則加入科立得試劑可能顯藍光，則該水樣不可用此方法。

9.5 此法無需在無菌室中進行，但操作過程因避免微生物污染。

9.6 檢測使用過的定量盤應滅菌后棄去。把約30個定量盤放入防爆袋中，用繩子松松的扎住袋口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓滅菌20min后取出，在防爆袋上注明“生物垃圾已滅菌”方可棄去。

附表1：51孔定量盤MPN表

附表2：97孔定量盤MPN表